Erklärt: Warum werden mehrere Personen mit Covid-Symptomen negativ getestet?
Viele Menschen mit Covid-19-Symptomen wurden negativ getestet. Es gibt mehrere wahrscheinliche Gründe, wie zum Beispiel Mutationen des Virus, die dem Nachweis entgangen sind, die Qualität der Probenahme und des Tests und die Wirksamkeit von RT-PCR-Kits.
Tests können in verschiedenen Phasen schief gehen, von einer schlechten Probensammlung und -lagerung bis hin zu einer fehlerhaften Extraktion und Amplifikation. (Express-Foto: Vishal Srivastav) Da Indien Schwierigkeiten hat, die beispiellose Nachfrage nach RT-PCR-Tests zu bewältigen, deuten Berichte darauf hin, dass bis zu 20 % symptomatischer Covid-19-Patienten negativ getestet werden.
Dieser offensichtliche Trend zu falsch negativen Ergebnissen kann ernsthaften Patienten die Aufnahme ins Krankenhaus und die Intensivpflege verweigern, während sie asymptomatischen Patienten die Möglichkeit geben, sich zu bewegen und das Virus zu verbreiten. Der Trend hat Experten, darunter AIIMS-Direktor Dr. Randeep Guleria, dazu veranlasst, eine Covid-19-Behandlung für jeden zu empfehlen, der klassische Symptome unabhängig von RT-PCR-Ergebnissen zeigt.
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Warum falsch negative?
RT-PCR-Tests, die als Goldstandard in der Diagnose von Covid-19 gelten, sollen nicht perfekt sein. Die vom Indian Council of Medical Research (ICMR) für die Validierung eines RT-PCR-Tests geforderte Mindestsensitivität (Fähigkeit, positive Ergebnisse zu erkennen) beträgt 95 %. Das bedeutet, dass bis zu 5 % falsch negative Ergebnisse erwartet werden.
Während anekdotische Berichte darauf hindeuten, dass der Anteil falsch negativer Ergebnisse in ganz Indien zunimmt, gibt es noch keine Studie, die dies belegt.
Theoretisch bestimmen vier große Faktoren die Genauigkeit eines RT-PCR-Tests: die Viruslast der Person, die Qualität der Probensammlung und -verarbeitung, die Wirksamkeit des Testkits selbst und auch der Maßstab für die Testinterpretation.
VIRUSLAST: Typischerweise manifestiert sich Covid-19 angemessen am fünften Tag eines Infektionszyklus. Wird eine infizierte Person früher nach der Exposition getestet, kann sie Covid-negativ werden. Dies ist möglicherweise kein wesentlicher Faktor für den jüngsten falsch-negativen Trend, da bestimmte Covid-19-Mutanten anscheinend frühe Symptome zeigen.
Eine Reihe symptomatischer Patienten, die in RT-PCR-Tests falsch negativ getestet wurden, wurde anschließend in bronchoalveolären Lavage (BAL)-Tests, bei denen Proben aus den unteren Atemwegen durch ein Bronchoskop entnommen werden, als Covid-positiv bestätigt. Dies hat zu Vermutungen geführt, dass bestimmte Mutanten die oberen Atemwege umgehen, um auf die Lunge zu zielen – ein Szenario, das einem RT-PCR-Test basierend auf Proben aus der Nasenhöhle und dem Rachen die für ein genaues Ergebnis erforderliche Viruslast verweigern könnte.
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KAPAZITÄTSEXPLOSION: Die Zahl der Covid-Testlabore in Indien stieg von 14 im Februar 2020 auf mehr als 2.400 im April 2021. Eine solch schnelle Expansion erforderte die Zulassung Hunderter Labors für RT-PCR-Tests und die Ausbildung Tausender Techniker in Eile.
Als Sicherheitsmaßnahme listete das ICMR im Juli 2020 30 Qualitätskontrolllabore auf, um alle von ihm genehmigten Covid-Labors zu überprüfen. Seitdem sind weitere 8 QC-Labore hinzugekommen. Quellen in mehreren Labors in drei Bundesstaaten sagten jedoch, dass nur wenige Inspektionen von Einrichtungen und Instrumenten stattgefunden haben.
Idealerweise sollte in regelmäßigen Abständen eine Mischung aus positiven und negativen Proben aus jedem Labor zur erneuten Untersuchung nach dem Zufallsprinzip entnommen werden. Wurde das jemals gemacht? Ja. Wurde das konsequent gemacht? Nein, sagte ein Wissenschaftler eines ICMR-Instituts, der nicht berechtigt ist, mit den Medien zu sprechen.
Das ICMR und eine Reihe von QC-Labors wurden seit Juli 2020 für die regelmäßige Laborüberwachung und Daten zur Qualitätskonformität herangezogen.
MENSCHLICHES ELEMENT: Tests können in verschiedenen Phasen schief gehen – von der Probenentnahme und -lagerung mangelhaft bis hin zur fehlerhaften Extraktion und Amplifikation. Alle RT-PCR-Kits enthalten eine interne Kontrolle (IC) zum Schutz vor einem Szenario, in dem keine RNA extrahiert/amplifiziert wird, was zu einem falsch negativen Ergebnis führt. Die IC kann exogen oder endogen sein. Es ist exogen, wenn jeder Probe vor der RNA-Extraktion ein künstliches RNA-Matrizenmolekül zugesetzt wird. Der Test gilt als ungültig, wenn die synthetische RNA nach der Extraktion nicht nachgewiesen wird und ein erneuter Test verordnet wird. Und eine endogene Kontrolle verwendet ein menschliches „Haushalts“-Gen, das in der Probe vorhanden ist; seine Nichterkennung nach dem RNA-Extraktionsverfahren macht den Test ungültig.
Ein menschliches Haushaltsgen stellt auch die Probenqualität sicher… Aber über 75 % RT-PCR-Kits auf dem indischen Markt verwenden die billigeren exogenen internen Kontrollen, sagte ein Molekularbiologe aus Mumbai.
In der SOP der ICMR vom April 2020 zur RT-PCR wurde festgestellt, dass die exogene Kontrolle für die Extraktion ignoriert werden kann, da sie die Qualität der entnommenen Probe nicht widerspiegelt. Es wurde empfohlen, separate RNase P oder jedes andere humane Haushaltsgen … parallel in einem separaten Röhrchen laufen zu lassen … (um) sowohl die Qualität der entnommenen Probe als auch das Extraktionsverfahren zu überprüfen.
Im Mai 2020 legte die von ICMR/HLL aufgelegte Mega-Ausschreibung für RT-PCR-Kits ähnliche Anforderungen fest. Eine Reihe von Herstellern argumentierte, dass verschiedene Unternehmen unterschiedliche interne Kontrollen verwenden, einschließlich exogener Kontrollen, die von Aufsichtsbehörden wie der FDA und CEIVD genehmigt wurden, und dass eine nachteilige Selektion auf der Grundlage von Haushaltsgenen einen fairen Wettbewerb verhindern würde. Schließlich wurde die Ausschreibung überarbeitet, um sowohl endogene als auch exogene Optionen für die interne Kontrolle aufzunehmen.
VIRALE MUTATION: Ein RTR-PCR-Test zielt auf bestimmte Bereiche eines oder mehrerer viraler Gene ab, um sein Vorhandensein nachzuweisen. Ein Test kann falsch negative Ergebnisse liefern, wenn eine Mutation in dem untersuchten Genomsegment auftritt. Tests, die mehrere genetische Ziele verwenden, wie sie in Indien verwendet werden, werden weniger wahrscheinlich durch Mutationen getäuscht.
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Aufsichtsbehörden wie die US-amerikanische FDA überwachen routinemäßig die Auswirkungen von Mutationen auf RT-PCR-Tests Während Experten wie Dr. Rakesh Mishra, Direktor des Zentrums für Zell- und Molekularbiologie (CCMB) in Hyderabad, der Meinung sind, dass ICMR eine ähnliche Übung einleiten sollte, ist dies möglicherweise nicht der Fall Einfach zu überwachende Echtzeit über 200 RT-PCR-Kits, die in Indien gegen neu auftretende Mutationen zugelassen sind.
Zum einen hat (oder wird) kein Hersteller die detaillierten Sequenzen seiner Testziele veröffentlicht. Bei der Einreichung zur Validierung beim ICMR erwähnen sie nur die Zielgene und nicht die Primersequenz, sagte ein leitender Forscher des Gesundheitsministeriums.
Bis jetzt gibt es jedoch Grund, ziemlich zuversichtlich zu sein, selbst wenn keine Echtzeit-Wirksamkeitsprüfung durchgeführt wird. Bisher weisen Covid-19-Varianten hauptsächlich Mutationen im S-Gen (Spike-Protein) auf. Die Mehrheit der Kits hier verwenden konservierte (unveränderte) Zielregionen, sagte Dr. Shanta Dutta, Direktorin des National Institute of Cholera and Enteric Diseases (NICED), Kolkata.
Preisabsturz
In einem Jahr fiel der Preis des RT-PCR-Kits von über 1.100 Rupien auf unter 40 Rupien. Da die Einfuhrzollbefreiung im Oktober 2020 zurückgezogen wurde, verließen die meisten ausländischen Marken den indischen Markt aufgrund der zusätzlichen Kostenbelastung von 15%. Auch eine Reihe indischer Marken haben sich geweigert, unter 100 Rupien zu verkaufen. Viele haben engagierte Firmenkunden gefunden, denen es nichts ausmacht, ein wenig mehr zu zahlen, um die Qualität zu gewährleisten. Einige bieten sogar mehrere PCR-Kits zu unterschiedlichen Preisniveaus an.
Obwohl es niemand aktenkundig sagt, stellen viele die Qualität der billigeren Konkurrenz in Frage. Die Gegenansicht ist, dass jedes auf dem Markt erhältliche Testkit die Validierungs-Benchmarks von ICMR erfüllt und dass jeder Preiskampf letztendlich dem Verbraucher zugute kommt.
Allerdings sind nicht alle überzeugt. Die entsprechende Senkung der Kosten für den Labortest beträgt von 4.500 Rupien auf 800 Rupien. Weiß man außerdem, welches Kit verwendet wird, wenn man ihr lokales Labor für einen Covid-Test besucht? Wie viele Labore werden Rs 100 ausgeben, wenn sie mit einem Rs-40-Kit davonkommen können? sagte einer der ersten indischen Hersteller von Covid-PCR-Kits.
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Der Ct-Wert
Ein RT-PCR-Test amplifiziert die aus der Probe extrahierte Nukleinsäure, um die für das Covid-19-Virus spezifische nachzuweisen. Die Verstärkung erfolgt in Zyklen mit einem Schwellenwert (Ct)-Wert. Je höher die virale Präsenz/Beladung, desto niedriger ist eindeutig der Ct-Wert oder die Anzahl der Amplifikationszyklen, die erforderlich sind, um es nachweisbar zu machen.
ICMR stellte den Ct-Wert bei negativen Ergebnissen auf 35 ein. Darüber hinaus gilt jede potenziell vorhandene Virusspur als vernachlässigbar und die Probe wird als Covid-negativ eingestuft.
Einige Staaten wie Maharashtra versuchten jedoch, die Zulässigkeitsgrenze zu erweitern, indem sie einen Ct-Wert von 24 vorschlugen. Da dies potenziell eine große Anzahl von Menschen mit einer quantitativ niedrigeren, aber klinisch signifikanten Viruslast ausschließen würde, bekräftigte die ICMR ihre Position zu einem Ct-Wert von 35 .
Es besteht jedoch wenig Klarheit, wenn alle Staaten denselben Ct-Benchmark verfolgen. Laut leitenden Angestellten von mindestens zwei Multi-State-Labornetzwerken haben sie widersprüchliche und zeitweise ungerechtfertigte mündliche Anweisungen zu solchen Testparametern erhalten. Auch ein molekularer Test ist nicht immun gegen subjektive Verzerrungen.
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